SPP 1623: Peptidtemplat-gesteuerte Biokonjugation an Proteinen in und auf lebenden Zellen für Untersuchungen von GPCR-Transport und -Kreuzreaktivit?t

Die Aktivit?t von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren h?ngt von ihrer Lokalisation in der Zelle, der Rezeptordichte und ihrer Mobilit?t in der Membran ab. Für einige Rezeptoren ist eine essentielle Dimerisierung bekannt, bei anderen wird sie vermutet oder es wurde eine ver?nderte Pharmakologie bei Heterodimerisierung beschrieben. Mit Hilfe von mikroskopischen Verfahren konnten wertvolle Erkenntnisse über die Funktion von GPCR in lebenden Zellen erzielt werden. Allerdings k?nnen die fluoreszierenden Gruppen, die am Rezeptor eingeführt werden müssen, abh?ngig von ihrer Gr??e die Funktion (Ligandenbindung, Export zur Zellmembran, Rezeptorinternalisierung) wesentlich beeinflussen. In der ersten F?rderperiode gelang uns die Entwicklung einer Markierungsmethode von Transmembranrezeptoren, die nur kleine zus?tzliche Peptidsegmente ben?tigt, mit hoher Spezifit?t auch in lebenden, eukaryontischen Zellen erfolgt und innerhalb von Minuten praktisch jede Art der kovalenten Modifizierung einführen l?sst. Die so markierten Rezeptoren sind vollkommen aktiv in allen untersuchten Testsystemen, wie Ligandenbindung, Signaltransduktion und Internalisierung. Unsere Methode wurde bislang für extrazellul?re Rezeptorsegmente gezeigt. Im Verl?ngerungsantrag planen wir die Vorteile unserer Markierungsstrategie (geringe Gr??e, hohe Flexibilit?t) beizubehalten und Verfahren zu entwickeln, die es erm?glichen i) intrazellul?re Proteine (Adiponektin-Rezeptor, Arrestinproteine, Regulatoren der G-protein-Signaltransduktion) zu markieren, ii) Multiplex-Reaktionen für Imaging-Verfahren einzusetzen, iii) Quantifizierung von Rezeptoren auf Zelloberfl?chen in lebenden Zellen zu etablieren (z. B. durch rolling cycle amplification nach Markierung der Rezeptoren mit PNA und anschlie?ender Hybridisierung mit DNA) und iv) die Oligomerisierung von Rezeptoren zu kontrollieren und ihre pharmakologische Relevanz aufzukl?ren (durch Hybridisierung der PNA-markierten Rezeptoren mit DNA definierter L?nge). Die Methoden, die in diesem gemeinsamen Projekt entwickelt werden, erlauben es uns, die Dynamik physiologisch wichtiger Rezeptoren zu charakterisieren, wie die der Y-, NPFF-, CRF und Ghrelin-Rezeptoren. Wir planen, die Kreuzreaktivit?t dieser Rezeptoren zu untersuchen, die für Liganden zug?ngliche Rezeptordichte auf der Zelloberfl?che zu quantifizieren und die Dynamik (durch FRET) und Zeitabh?ngigkeit (durch pulse-chase-Experimente) ihrer intrazellul?ren Wege und Interaktionspartner zu charakterisieren. Weiterhin planen wir, das Konzept auf semi-synthetische Rezeptoren zu erweitern, wobei wir mit Hilfe von neuen Modifizierungsreagenzien lipidierte und pegylierte Rezeptoren generieren und somit den Einfluss unterschiedlicher Hydrophobizit?t auf die Signalkaskaden untersuchen k?nnen.