Neuartige analytische Ans?tze für die Quantifizierung niedrigabundanter, dynamischer Metaboliten des Vitamin-D-Stoffwechsels

Das Ziel des Folgeantrags ist die Entwicklung neuartiger massenspektrometrischer (MS) Verfahren zur detaillierten Metabolom-Analyse von Vitamin D. Vitamin D beschreibt eine Gruppe von Secosteroiden, von denen Vitamin D3 der wichtigste bioaktive Vertreter ist. Vitamin D-Mangel spielt bei Knochenerkrankungen eine wichtige Rolle, wird aber zunehmend auch mit anderen Krankheiten wie z.B. Krebs und chronischen Lebererkrankungen in Verbindung gebracht. Für die Bestimmung von Vitamin D gibt es zahlreiche klinische Assays, die aber im Hinblick auf Empfindlichkeit und Genauigkeit Schw?chen aufweisen. Heute setzt man daher zunehmend LC-MS/MS-Methoden ein, da diese Techniken zum einen unterschiedliche Vitamin D-Spezies unterscheiden k?nnen, und zum anderen h?here Empfindlichkeit und Selektivit?t liefern. Die Messungen erfordern jedoch erhebliche Erfahrung, um die zahlreichen Fehlerm?glichkeiten und inh?renten Schw?chen der Technik zu erkennen. Wir haben im Rahmen der ersten F?rderphase neue Analysetechniken entwickelt, die gezielt auf die wichtigsten Schwachstellen eingehen und diese umgehen oder beseitigen. Daneben haben wir chemische Markierungswerkzeuge zur Erh?hung von Empfindlichkeit und Selektivit?t entwickelt, die es uns erlaubten, zahlreiche Metaboliten des Vitamin D quantitativ im Serum von Patienten zu erfassen. Daneben haben wir ein neues Kalibrierungsmodell für die Trockenblutanalyse von Vitamin D entwickelt und erstmals die schnelle MALDI-MS zur quantitativen Analyse des Vitamin D-Statusmarker eingesetzt. Im Rahmen des Fortsetzungsantrags werden wir neue MS-Techniken entwickeln, die viel weiter in das Vitamin D-Metabolom eindringen k?nnen und sich gezielt mit der Entdeckung und der Quantifizierung sehr niedrigabundanter, dynamischer Metaboliten des Vitamin D besch?ftigen
werden. Viele dieser Transformationsprodukte lie?en sich bisher in Humanproben nicht oder nur schwer nachweisen, da keine Techniken mit ausreichender Sensitivit?t zur Verfügung stehern. Sie sind teilweise aber in Mikrosomenstudien erzeugt bzw. über das Wirkspektrum Vitamin D-aktiver Enzyme postuliert worden. Daneben wollen wir den parallelen Epimer-Metabolisierungsweg von Vitamin D erstmals genauer mit LC-MS/MS Methoden untersuchen, sowie v?llig neue Methoden für die Bestimmung des freien Vitamin D und der verschiedenen Proteinbindungsformen untersuchen. Wir schlagen die sog. Membraneinla?-MS für diesen Zweck vor sowie die Trennung der Spezies mittels ?Turbulent Flow“ S?ulen. Ein weiteres Ziel dieses Forschungsvorhabens ist die Ermittlung des diagnostischen Potentials der metabolischen Fingerabdrücke von Vitamin D aus Verlaufsmessungen klinischen Studien. So soll u.a. ein statistisches Modell für das Ansprechverhalten von Patienten auf Vitamin D Supplementation nach Einmaldosis von Cholecalciferol aus den gemessenen metabolischen Daten konstruiert werden, welches Dosisvorschl?ge zum Erreichen einer Zielkonzentration des Vitamin D-Statusmarkers im Blut erm?glicht.