Analyse funktioneller Hirnverbindungen mittels in vivo Optogenetik und Holographie

Die Beziehung zwischen Funktion und Vernetzung in kortikalen Schaltkreisen waren lange Gegenstand neurowissenschaftlicher Untersuchungen. Obwohl seit Jahrzehnten die Hauptwege kortikaler Informationsverarbeitung prim?rer sensorischer Areale beschrieben werden, ist weiter unklar, wie die Stimulusselektivit?t mit der St?rke der synaptischen Konnektivit?t innerhalb und zwischen den kortikalen Laminae zusammenh?ngt. Kürzlich gab es Hinweise für eine Korrelation zwischen der Wahrscheinlichkeit horizontaler exzitatorischer Verbindungen und der Stimulus?pr?ferenz in den Schichten 2/3 und V1 in der Maus. Um zu überprüfen, in welchem Ausma?e solche funktionellen horizontalen und vertikalen Verbindungen wirklich korrelieren, müssen wir die M?glichkeit schaffen, dreidimensional (3D) mit zellul?rer optischer Aufl?sung und ms zeitlicher Pr?zision Zellen anzuregen und die Aktivit?t vieler Zellen auszulesen.
Der klassische Ansatz, zur Verbindungskartierung Mikroelektroden zu insertieren kann nicht für hunderte von Neuronen in vivo realisiert werden. Um die Patch-Elektroden durch Licht zu ersetzen, liefern jüngere Entwicklungen in der Optogenetik mit den relevanten molekularen und optischen Verbesserungen vielversprechende L?sungen, um kortikale Vernetzungen mit der geforderten r?umlichen und zeitlichen Aufl?sung zu studieren. Im vorgeschlagenen Projekt wollen wir die Verbindungsmuster und die damit verbundene visuelle Prozessierung im V1-Bereich des Mausgehirns durch Verbindung der Expertise der beiden Partnerteams studieren, d.h. Wellenfront-Sch?rfungsmethoden des Emiliani-Labors und die Entwicklung optogenetischer Aktuatoren des Hegemann-Labors.
Unser holographischer Lichtmuster-Ansatz hat die M?glichkeit zur in vivo Generierung von Aktionspotentialen (APs) über Zweiphotonen(2P)-anregung erschlossen. Die Verwendung von ins Soma gesteuerter Opsine sichert Einzelzell-spezifische Anregung. Zur ms-genauen AP Anregung in neuronalen Lagen L2/3, L4m und L5 in vivo, werden wir die optischen und molekularen Parameter zur 2P-Anregung und Bildverarbeitung bis zu 1 mm Tiefe unter der Hirnoberfl?che verbessern. Zum Einsatz einer Opsin-Anregung/Auslese-Kombination mit minimalen spektralem ?berlapp werden wir anwendungsoptimierte Opsine mit angepassten Spektren, Kinetiken und Ionenselektivit?ten zum Einsatz bringen und diese mit genetisch kodierbaren Ca2+- und Spannungs-indikatoren anregungstechnisch über unser neuestes 3D-Liniensch?rfungssystem verbinden. Um den Lichtintensit?tsverlust durch Gewebestreuung zu minimieren, werden wir zeitliche und lokalstrukturierte Lichtmusterung und Infrarot-sensitive Rhodopsinen verwenden.
Um die frühere indirekte Korrelation von in vivo Anregung mit stark verz?gerter Musteranalyse zu überwinden, sollen im vorgeschlagenen Projekt sowohl Anregung als auch die Aktivit?ts-Analyse in vivo erfolgen.
Bei sequentieller Bewegung holographischer Belichtungsflecken über die kortikalen Schichten hinweg werden wir horizontale und vertikale Verbindungen mit stark verbesserter Pr?zision analysieren. Der Hauptvorteil unserer holographischen Methode ist die Generierung einzelner pr?synaptischer APs und die Analyse postsynaptischer Verbindungen basierend auf einzelnen postsynaptischen EPSPs. Die Aktivit?tsauslesung erfolgt zus?tzlich über Spannungsindikatoren, die zu einem ?All-optical-Mapping“ führen, das zu einem vertieften Verst?ndnis der Signaltransduktion auf kortikalem zellul?ren Niveau führt