Different Sensitivity of Selected Planktonic Eukaryotic and Prokaryotic Phototrophs to Dissolved Humic Substances: Potential Modes of Action and Ecological Implication

Mehrfach unges?ttigte, langkettige Fetts?uren (LC-PUFA) sind wichtige Zellbestandteile in Membranen und dienen als Vorstufen für eine biologisch hoch aktive Gruppe von Signalmolekülen, den Eicosanoiden. Ziel dieses Projekts ist die Aufkl?rung der Rolle von Cytochrom P450 (CYP)-abh?ngigen Eicosanoiden bei der Regulation der Pharynxaktivit?t des Nematoden Caenorhabditis elegans. Wir postulieren, dass die Bildung der CYP-33E2-abh?ngigen Eicosanoide in den Marginalzellen des Pharynx als Antwort auf die Ausschüttung von spezifischen Transmittern durch die benachbarten neuronalen Zellen erfolgt. Die gebildeten CYP-Eicosanoide wirken dann parakrin auf die Kontraktilit?t der benachbarten Muskelzellen. Aus physiologischer Sicht k?nnte dieser Mechanismus zur Feinabstimmung des Fressverhaltens dienen. Zur Prüfung unserer Hypothesen wollen wir im ersten Teil des Projekts zun?chst untersuchen, welchen Effekt die einzelnen von CYP-33E2 erzeugten LC-PUFA-Metabolite auf die Pharynxaktivit?t haben. Im zweiten Teil soll analysiert werden, für welche der bekannten Neurotransmitter die CYP-Eicosanoide tats?chlich als sekund?re Botenstoffe fungieren. Schwerpunkt des dritten Teils wird dann die Identifizierung von G-Protein-gekoppelten-Membranrezeptoren (GPCR) sein, die als m?gliche prim?re Targets der CYP-Eicosanoide fungieren. Der grundlegende Versuchsaufbau des ersten und zweiten Teils besteht in einer Kurzzeit-Behandlung von adulten Nematoden mit verschiedenen Eicosanoiden als auch Neurotransmittern und einer anschlie?enden Bestimmung der Pharynxaktivit?t am Binokular (Pumpfrequenz) als auch mittels eines Fütterungstests mit fluoreszierenden Polystyrolpartikeln (Aufnahmetest). Mit Hilfe von Ca2+-bindenden Cameleon-Konstrukten wird am konfokalen Lasermikroskop eine m?gliche Beeinflussung der rhythmischen Ca2+-Oszillation in den aktiven pharyngalen Muskel-zellen untersucht. Für die Experimente sollen sowohl ad libitum gefütterte als auch gehungerte adulte Nematoden unterschiedlichen Alters aus Synchronkulturen sowie Tiere, deren Eicosanoidproduktion blockiert worden ist, eingesetzt werden. Schlussendlich wird über LC-MS/MS bestimmt, inwiefern Modulationen der Pharynxaktivit?t bzw. die Behandlung mit Neurotransmittern in vivo von einer Ver?nderung des freien Eicosanoidmusters begleitet sind. Die Hemmung der Expression des verantwortlichen Rezeptors durch RNA-Interferenz (RNAi) sollte zu einem Ausfall des Effekts von ausgew?hlten CYP-Eicosanoiden auf die Pharynxaktivit?t führen. Darauf basierend wollen wir im dritten Teil ein Screening durchführen, bei dem alle aus dem Genom von C. elegans bekannten GPCRs auf ihre potentielle Rolle als Vermittler des Pumpfrequenz-ver?ndernden Effekts von CYP-Eicosanoiden getestet werden. Der Versuchs-aufbau besteht in einer Synchronisation von L1-Larven des RNAi-hypersensitiven Stammes rrf-3(pk1426), der Fütterung der entsprechenden dsRNA produzierenden Escherichia coli Bakterien, dem Umsetzen von adulten Tieren, der kurzzeitigen Zugabe von CYP-Eicosanoid (plus je-weils einer parallelen Kontrolle ohne Exposition) und einer finalen Zufütterung der Fluoreszenz-markierten Beads. Die prim?re Auswertung des Tests besteht im Vergleich der inkorporierten Fluoreszenz mit bzw. ohne Eicosanoid-Exposition, positive Kandidaten werden weiter überprüft. Aus evolution?rer Sicht k?nnte der Pharynx von C. elegans ein Modell für die Entwicklung von CYP-Eicosanoid-abh?ngigen Signalwegen darstellen. Ein m?gliches Gegenstück zur Rolle von CYP-33E2 bei der Regulation der Pharynxaktivit?t von C. elegans k?nnte die Funktion von CYP2C und CYP2J Isoformen bei der Regulation der Kontraktilit?t von Gef??- bzw. Herzmuskelzellen bei S?ugern sein. Die Identit?t der CYP-Eicosanoid-Rezeptoren ist dabei eine zentrale und bisher ungel?ste Frage der gesamten Forschung auf dem Gebiet der CYP-Eicosanoide. Die Verwendung von C. elegans als Modelorganismus bietet einen neuartigen experimentellen Zugang zur Beantwortung dieser Frage.